В настоящее время для генетического исследования используют:

FISH (fluorescence in situ hybridization) молекулярно‐цитогенетический метод был разработан для выявления определенных последовательностей ДНК на хромосоме и применим как для метафазных, так и для интерфазных ядер.

Метод основан на связывании ДНК-зонда, меченного флюоресцентным красителем, с ДНК хромосомы исследуемого образца.

FISH может применяться при выявлении количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как делеции ( в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия; на интерфазных хромосомах служит методом диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом.

Метод позволяет:

• проводить скрининг преимплантационных эмбрионов по наиболее частым анеуплоидиям хромосом 8,9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X, Y;
• определить генетический пол эмбрионов;
• проводить ПГД эмбрионов у носителей хромосомных перестроек.

Ограничения метода:

• методика не может включать в себя определения 24 типов хромосом (для FISH- диагностики используется ограниченное количество зондов, позволяющих осуществлять детекцию только самых распространенных хромосомных аномалий);
• колоссальная зависимость от качества фиксации (наслоение сигналов, низкая эффективность гибридизации, нарушения процесса фиксации бластомеров , до 6‐10% эмбрионов без диагностики).
• не позволяет исключить мозаицизм;
• диагностика проводится на конкретную патологию, и не позволяет исключить аномалию в не исследуемых участках;
• нельзя отличить сбалансированный от нормального (С помощью FISH-анализа выявляются эмбрионы с несбалансированными нарушениями. Сбалансированные варианты (как у родителя с перестройкой) не могут быть выявлены с применением данного метода. Поэтому среди эмбрионов, рекомендованных для переноса, могут быть эмбрионы как нормальные, так и носители хромосомной перестройки).
• нельзя выявить однородительскую дисомию;
• невозможно совмещать с другими видами ПГД(на моногенные заболевания, HLA)

В настоящее время для ПГД активно применяют realTime ПЦР.

Метод использует общие принципы ПЦР которые заключаются в удвоении (амплификации) участка ДНК, ограниченного праймерами, при помощи фермента ДНК-полимеразы. В результате этого число фрагментов растет в геометрической прогрессии. После 30 - 40 циклов их число превышает несколько миллиардов, что делает возможным их обнаружение различными методами. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации а выявление ампликонов осуществляется по флюоресценции зондов, либо красителя SybrGreen, и не требует проведения электрофореза.

Данная техника позволяет с высокой степенью достоверности определить точечные мутации, количественное содержание ДНК в пробе, а также для определения уровня экспрессии генов.

ПГД на определенные моногенные заболевания проводится в том случае, если в семье встречались случаи данного заболевания. Сначала делается предварительная диагностика родителей на носительство мутантного гена, а затем уже выполняют процедуру ЭКО в сочетании с ПГД с целью выявления именно этого генетического дефекта у эмбрионов. Этот метод позволяет проводить быструю детекцию наиболее распространенных анеуплоидий. Точность метода по определению наиболее частых видов анеуплоидий сравнима с таковой у FISH.

Преимущества:

• возможность выполнения всех видов ПГД;
• позволяет детектировать уровень мозаицизма порядка 20—30%;
• возможность одновременного проведения ПГС и ПГД;
• относительная дешевизна и возможность одновременного анализа гораздо большего количества образцов;
• скорость выполнения исследований;
• экономия затрат времени и труда.

Недостатки:

• способен лишь обнаруживать специфические хромосомные изменения, не позволяя проводить детекцию нарушений, лежащих вне пределов, ограниченных праймерами;
• большая трудоемкость подготовительного этапа;
• отсутствие коммерческих наборов.

Современной альтернативой методу FISH является метод сравнительной геномной гибридизации на микрочипах.

аCGH - конкурентная гибридизация in situ двух геномных ДНК библиотек, одной – полученной из анализируемой ткани/единичных клеток, второй – контрольной (из лимфоцитов периферической крови здорового индивида), взятых в равном соотношении и меченых разными флуорохромами на мембрану/микрочип, на котором расположены тысячи локус-специфических ДНК-фрагментов здорового человека.

Использование микрочипов привело к высокой разрешающей способности, объективности и высокой информативности полученных результатов.

Данный метод позволяет протестировать все 24 хромосомы (1-22, XY) одновременно, анализ множества генов и целых геномов в одном эксперименте. Установлено, что риск ложноположительного и ложноотрицательного результата при CGH не превышает 1 %.

Возможности aCGH

Выявление численных аномалий хромосом (анеуплоидии), включая мозаичные варианты.

Детекция структурных аберраций хромосом:

• несбалансированные транслокации;
• микроделеции/микродупликации;
• несбалансированные субтеломерные перестройки;
• маркерные хромосомы.
• возможность определения дисомий

Ограничения aCGH

Результаты исследования не исключают наличия сбалансированных перестроек:

• реципрокных транслокаций;
• инверсий;
• робертсоновских транслокаций;

Несбалансированных перестройек за границей разрешения:

• делеций и дупликаций ниже границы чувствительности;
• точечных мутаций.

В случае детекции перестроек «на границе чувствительности» метода необходима FISH или/и ПЦР‐верификация.

Ограниченная возможность детекции полиплоидии и мозаицизма(от 30%)

Результативность метода зависит от качества исходного материала, значимости отклонений, нарушения и особенности амплификации всего генома(WGA).

Секвенирование нового поколения - техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания ее структуры.

Классический метод секвенирования по Сэнгеру («метод обрыва цепи»), оказался не подходящим для быстрого рутинного секвенирования человеческих геномов в клинических целях. Поэтому появилась необходимость в изобретении новых технологий полногеномного секвенирования.

NGS (New Generation Sequensing) - использует самые современные на сегодняшний день методы чтения генетической информации для тестирования эмбрионов и открывает новые диагностические возможности. Метод предоставляет исчерпывающую информацию о ДНК эмбриона в отношении заболеваний или генетических мутаций.

Преимущества:

• возможность тестирования всех 24 хромосом одновременно с беспрецедентной точностью;
• увеличение точности для диагностики мозаичных анеуплоидий;
• можно отличить сбалансированный от нормального;
• можно выявить однородительскую дисомию (при анализе образцов родителей );
• можно определить гаплоидов и триплоидов;
• возможность выявления микро и макро перестроек (от 10 п.н.);
• возможность одновременной диагностики моногенных заболеваний;
• в ПГД NGS для каждого образца назначен дополнительный молекулярный код, исключая возможность ошибки;
• низкая себестоимость расходных материалов;

Ограничения:

• нельзя определить тетраплоидов;
• высокая стоимость оборудования.

В процессе секвенирования генома получаем информацию о всей ДНК, находящейся в 23 хромосомах клеток человека, которые содержат примерно 3 млрд. пар нуклеотидов. Эта информация включает последовательности всех генов ( 20 тыс.) и некодирующих участков (которые составляют большую часть генома человека и участвуют, в частности, в регуляции работы генов). Таким образом, в результате одного исследования (секвенирования) генома возможно получить гигантский массив информации, который будет использоваться в клинической практике, как с уже имеющимися данными, так и с данными, которые учёные будут получать по мере научного прогресса в будущем.