Наши статьи

Криоконсервация. Все, что вы хотите знать, но боитесь спросить

Что такое криоконсервация? Для чего она нужна? Как она работает?

Лед

Вы знаете, почему свежее мясо вкуснее, чем замороженное? И почему нельзя заморозить человека и сохранить в морозилке до лучших времен?
Ответ на оба вопроса один и тот же. Любая клетка и любая ткань содержит огромное количество воды. При температуре выше нуля вода в организме существует в виде жидкости или в особом состоянии, напоминающем жидкие кристаллы, в котором молекулы плотно упакованы вокруг различных макромолекул или ионов и образуют подобие шубы. Последнее называют структурированной водой и, по современным представлениям, большая часть воды в любом организме находится в этом состоянии. В любом случае, в обоих состояниях молекулы воды расположены достаточно плотно и не образуют так называемого «дальнего порядка» – кристаллической структуры, или узора большого надмолекулярного масштаба. Плотность такой воды близка к 1.
При понижении температуры ниже определенного значения (это не обязательно 0°C), вода, как и большинство других жидкостей, начинает кристаллизоваться, образуя лед. При этом возникает кристаллический узор, значительно более крупный, чем размеры молекул – появляется дальний порядок. В отличие от большинства других жидкостей, плотность льда меньше, чем плотность жидкой воды, потому что образующийся кристаллический узор весьма ажурен.
Тем не менее, несмотря на красоту и ажурность ледяных структур (вспомните снежинки или узоры на стекле), они абсолютно губительны для клетки. Если бутылку, до верху заполненную водой, поместить в морозилку, ее разорвет. Точно так же при кристаллизации внутриклеточной воды, она разрывает внутриклеточные структуры и убивает клетку.
Именно поэтому мясо после замораживания – совсем не тот продукт, что был до того.

Защита ото льда

И все-таки, это – не вся правда. Почему же, в таком случае, лягушка спокойно вмерзает в лед и оживает следующей весной?
Существуют особые вещества, называемые «криопротекторы», которые препятствуют образованию кристаллов льда. Механизм их действия достаточно прост: это либо крупные молекулы, образующие вязкий раствор, и играющие роль «барьеров» на пути роста кристаллов люда, либо достаточно маленькие молекулы, которые замещают воду внутри клетки и тем самым предотвращают кристаллообразование: нет воды – нет проблемы. Первые – это так называемые «непроникающие криопротекторы»; вторые – «проникающие». К первым относятся сахароза, другие сахара и фикол, ко вторым – этиленгликоль, диметилсульфоксид и глицерин (который можно отнести к обеим группам).
Лягушка «пользуется» глюкозой и глицерином. Для человеческих клеток этого, как правило, не достаточно, но можно подобрать оптимальную комбинацию криопротекторов, чтобы в меру обезводить клетку проникающими криопротекторами и в меру защитить ее снаружи непроникающими. Проблема, которая заставляет подбирать их оптимальное сочетание – это необходимость сделать обезвоживание и замораживание обратимым. Чрезмерное обезвоживание клетки может также оказаться губительным: «слипшиеся» в отсутствие воды внутриклеточные структуры могут не расправиться. Кроме того, среди криопротекторов немало токсичных веществ.

Криоконсервация в биологии и медицине

Тем не менее, для некоторых типов клеток подобрана оптимальная методика криоконсервации – т.е. такая последовательность растворов, через которую можно «провести» клетку, эмбрион или кусок ткани и после этого заморозить. При этом эти растворы (1) достаточно хорошо защищают клетки от образования кристаллов льда (при соблюдении правильной динамики охлаждения) и (2) не настолько токсичны, чтобы отравить эмбрион (или ткань) за время обработки.
«Последовательность» растворов означает, что ткань или эмбрион помещают сначала в один раствор криопротекторов (на строго определенное время), затем в другой – более концентрированный – и т.д. Такое постепенное повышение концентрации криопротекторов до конечной (необходимой для замораживания) позволяет избежать явления осмотического шока – резкого необратимого нарушения внутриклеточных структур при излишне быстром перепаде концентрации ионов и криопротекторов.
Существует два принципиально различных подхода к замораживанию биологических объектов.

1. Медленное замораживание

Это – первый появившийся подход, показавший в свое время хорошие результаты, но в настоящее время по большей части оставленный. При медленном замораживании объект (выдержанный определенное время в растворе криопротекторов) помещают в капилляр с раствором для замораживания и постепенно охлаждают до температуры кристаллизации этого раствора и еще несколько ниже. Раствор оказывается в так называемом «переохлажденном состоянии», когда он готов кристаллизоваться в ответ на любой внешний импульс. Далее, точечно охлаждая капилляр вдали от объекта, запускают лавинообразную кристаллизацию раствора.
Попробуйте заморозить минеральную воду. Вы обнаружите, что по мере образования льда, оставшаяся жидкость будет становиться все более соленой. Причина этого в том, что кристаллы льда содержат преимущественно чистую воду, а соли остаются в той части раствора, которая пока не замерзла.
Точно так же по мере кристаллизации льда в капилляре с раствором криопротекторов, оставшаяся, еще не кристаллизованная часть раствора будет становиться все более концентрированной. Т.о. концентрация солей и криопротекторов вокруг нашего объекта (эмбриона или куска ткани) будет повышаться.
Как мы уже видели, криопротекторы не дают образоваться кристаллам слишком большого размера. Таким образом, кристаллы льда, образующиеся, в конце концов, вокруг объекта и внутри него, будут настолько малы, что не смогут «испортить» ни клетки, ни внутриклеточные структуры.
Основной задачей, в таком случае, станет надежно сохранить объект и, когда потребуется, быстро разморозить его – так, чтобы маленькие кристаллы льда не успели при повышении температуры рекристаллизоваться в большие кристаллы, которые нанесут вред клеткам.

2. Витрификация

Этот подход позволяет вообще избежать образования кристаллов.
Образование кристаллической решетки – процесс, хоть и быстрый, но все-таки требующий времени. Если бы жидкость удалось мгновенно охладить до очень низкой температуры, она так и замерла бы в жидком, некристаллизованном состоянии, образовав подобие стекла. Этот процесс так и называется – стеклование, или витрификация.
Стеклование чистой воды возможно только в очень экзотических условиях (скорость охлаждения ~ 1 млн градусов в секунду, или очень высокой давление). Однако и здесь, добавление оптимального сочетания криопротекторов позволяет провести витрификацию раствора и содержащихся в нем биологичеких объектов при нормальном давлении и достижимой скорости охлаждения.
При витрификации эмбрионы (или ткань) также последовательно выдерживают в нескольких, все более концентрированных, растворах криопротекторов, после чего мгновенно помещают в жидкий азот. При этом, за счет комплекса криопротекторов и частичного обезвоживания эмбриона (ткани), вода в клетке не успевает кристаллизоваться, и эмбрион остается «как есть». Основной задачей остается соблюдение стабильной температуры во время хранения (чтобы не допустить рекристаллизации воды) и максимально быстрое размораживание.
При размораживании необходимо также по возможности быстро (но постепенно – чтобы не допустить осмотического шока) избавиться от криопротекторов и перенести эмбрион в нормальную культуральную среду.

Современная криоконсервация

На данный момент отработаны методики замораживания сперматозоидов, яйцеклеток и эмбрионов.
Для спермы, как правило, используют медленное замораживание, которое, в среднем, дает выход ~60—70%. Кроме случаев с тяжелой патоспермией, такой эффективности для спермы более чем достаточно. Есть также несколько лабораторий, разрабатывающих методику витрификации спермы.
Для яйцеклеток и эмбрионов (от стадии пронуклеусов до бластоцисты) используют, в основном, витрификацию. Хорошие витрификационные среды и точное следование протоколу позволяют достичь эффективности почти 100% для эмбрионов и 70—100% для яйцеклеток. Эффективность замораживания—размораживания яйцеклеток сильно зависит от их исходного «качества». То же верно и для эмбрионов, но, в отличие от яйцеклеток, бесперспективные эмбрионы легко распознать, что позволяет их вообще не морозить.
Еще не решенной проблемой является замораживание целых тканей. Здесь сложность заключается в значительно большем размере «кусков», которые гораздо дольше уравновешиваются в криопротекторах (что повышает токсический эффект) и гораздо медленнее замерзают (что повышает риск кристаллообразования). Кроме того, в отличие от эмбрионов и половых клеток, размороженные ткани необходимо сразу трансплантировать (что связано с множеством своих сложностей и рисков).
Тем не менее, существуют методики замораживания тканей яичника и яичек, которые, хотя и относятся к экспериментальным, по-видимому, имеют весьма высокую эффективность. Эти подходы продолжают исследовать во многих лабораториях мира, но, при необходимости, уже используют в ряде ведущих клиник.
2021-07-08 22:53 ЭКО