МЕТОДЫ ПГД

В настоящее время для генетического исследования используют:

FISH (fluorescence in situ hybridization) молекулярно‐цитогенетический метод был разработан для выявления определенных последовательностей ДНК на хромосоме и применим как для метафазных, так и для интерфазных ядер.

Метод основан на связывании ДНК-зонда, меченного флюоресцентным красителем, с ДНК хромосомы исследуемого образца.

Гибридизация in situ с флуоресцентной меткой (FISH) ПГД

Гибридизация in situ с флуоресцентной меткой (FISH)

FISH может применяться при выявлении количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как делеции ( в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия; на интерфазных хромосомах служит методом диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом.

Метод позволяет:

  • проводить скрининг преимплантационных эмбрионов по наиболее частым анеуплоидиям хромосом 8,9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X, Y;
  • определить генетический пол эмбрионов;
  • проводить ПГД эмбрионов у носителей хромосомных перестроек.
Селекция пола(кариотип ХХ) ПГД

Селекция пола(кариотип ХХ)

Трисомия 21 хромосомы ПГД

Трисомия 21 хромосомы

Ограничения метода:

  • методика не может включать в себя определения 24 типов хромосом (для FISH- диагностики используется ограниченное количество зондов, позволяющих осуществлять детекцию только самых распространенных хромосомных аномалий);
  • колоссальная зависимость от качества фиксации (наслоение сигналов, низкая эффективность гибридизации, нарушения процесса фиксации бластомеров , до 6‐10% эмбрионов без диагностики).
  • не позволяет исключить мозаицизм;
  • диагностика проводится на конкретную патологию, и не позволяет исключить аномалию в не исследуемых участках;
  • нельзя отличить сбалансированный от нормального (С помощью FISH-анализа выявляются эмбрионы с несбалансированными нарушениями. Сбалансированные варианты (как у родителя с перестройкой) не могут быть выявлены с применением данного метода. Поэтому среди эмбрионов, рекомендованных для переноса, могут быть эмбрионы как нормальные, так и носители хромосомной перестройки).
  • нельзя выявить однородительскую дисомию;
  • невозможно совмещать с другими видами ПГД(на моногенные заболевания, HLA)

В настоящее время для ПГД активно применяют realTime ПЦР.

Метод использует общие принципы ПЦР которые заключаются в удвоении (амплификации) участка ДНК, ограниченного праймерами, при помощи фермента ДНК- полимеразы. В результате этого число фрагментов растет в геометрической прогрессии. После 30 — 40 циклов их число превышает несколько миллиардов, что делает возможным их обнаружение различными методами. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации а выявление ампликонов осуществляется по флюоресценции зондов, либо красителя SybrGreen, и не требует проведения электрофореза.

ПЦР в реальном времени ПГД

Данная техника позволяет с высокой степенью достоверности определить точечные мутации, количественное содержание ДНК в пробе, а также для определения уровня экспрессии генов.

ПГД на определенные моногенные заболевания проводится в том случае, если в семье встречались случаи данного заболевания. Сначала делается предварительная диагностика родителей на носительство мутантного гена, а затем уже выполняют процедуру ЭКО в сочетании с ПГД с целью выявления именно этого генетического дефекта у эмбрионов. Этот метод позволяет проводить быструю детекцию наиболее распространенных анеуплоидий. Точность метода по определению наиболее частых видов анеуплоидий сравнима с таковой у FISH.

Преимущества :

  • возможность выполнения всех видов ПГД;
  • позволяет детектировать уровень мозаицизма порядка 20—30%;
  • возможность одновременного проведения ПГС и ПГД;
  • относительная дешевизна и возможность одновременного анализа гораздо большего количества образцов;
  • скорость выполнения исследований;
  • экономия затрат времени и труда.

Недостатки:

  • способен лишь обнаруживать специфические хромосомные изменения, не позволяя проводить детекцию нарушений, лежащих вне пределов, ограниченных праймерами;
  • большая трудоемкость подготовительного этапа;
  • отсутствие коммерческих наборов.

Современной альтернативой методу FISH является метод сравнительной геномной гибридизации на микрочипах.

аCGH — конкурентная гибридизация in situ двух геномных ДНК библиотек, одной – полученной из анализируемой ткани/единичных клеток, второй – контрольной (из лимфоцитов периферической крови здорового индивида), взятых в равном соотношении и меченых разными флуорохромами на мембрану/микрочип, на котором расположены тысячи локус-специфических ДНК-фрагментов здорового человека.

PGD_metody_ACGH_001

Использование микрочипов привело к высокой разрешающей способности, объективности и высокой информативности полученных результатов.

ПГД Микрочип, содержащий около 40000 проб

Микрочип, содержащий около 40000 проб

Данный метод позволяет протестировать все 24 хромосомы (1-22, XY) одновременно, анализ множества генов и целых геномов в одном эксперименте. Установлено, что риск ложноположительного и ложноотрицательного результата при CGH не превышает 1 %.

Возможности aCGH

Выявление численных аномалий хромосом (анеуплоидии), включая мозаичные варианты.

Детекция структурных аберраций хромосом:

  • несбалансированные транслокации;
  • микроделеции/микродупликации;
  • несбалансированные субтеломерные перестройки;
  • маркерные хромосомы.
  • возможность определения дисомий

Ограничения aCGH

Результаты исследования не исключают наличия сбалансированных перестроек:

  • реципрокных транслокаций;
  • инверсий;
  • робертсоновских транслокаций;

Несбалансированных перестройек за границей разрешения:

  • делеций и дупликаций ниже границы чувствительности;
  • точечных мутаций.

В случае детекции перестроек «на границе чувствительности» метода необходима FISH или/и ПЦР‐верификация.

Ограниченная возможность детекции полиплоидии и мозаицизма(от 30%)

Результативность метода зависит от качества исходного материала, значимости отклонений, нарушения и особенности амплификации всего генома(WGA).

Секвенирование нового поколения — техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания ее  структуры.

Классический метод секвенирования по Сэнгеру («метод обрыва цепи»), оказался не подходящим для быстрого рутинного секвенирования человеческих геномов в клинических целях. Поэтому появилась необходимость в изобретении новых технологий полногеномного секвенирования.

Секвенирование нового поколения ПГД

 

NGS (New Generation Sequensing) — использует самые современные на сегодняшний день методы чтения генетической информации для тестирования эмбрионов и открывает новые диагностические возможности. Метод предоставляет исчерпывающую информацию о ДНК эмбриона в отношении заболеваний или генетических мутаций.

Преимущества:

  • возможность тестирования всех 24 хромосом одновременно с беспрецедентной точностью;
  • увеличение точности для диагностики мозаичных анеуплоидий;
  • можно отличить сбалансированный от нормального;
  • можно выявить однородительскую дисомию (при анализе образцов родителей );
  • можно определить гаплоидов и триплоидов;
  • возможность выявления микро и макро перестроек (от 10 п.н.);
  • возможность одновременной диагностики моногенных заболеваний;
  • в ПГД NGS для каждого образца назначен дополнительный молекулярный код, исключая возможность ошибки;
  • низкая себестоимость расходных материалов;

Ограничения:

  • нельзя определить тетраплоидов;
  • высокая стоимость оборудования.

В процессе секвенирования генома получаем информацию о всей ДНК, находящейся в 23 хромосомах клеток человека, которые содержат примерно 3 млрд. пар нуклеотидов. Эта информация включает последовательности всех генов ( 20 тыс.) и некодирующих участков (которые составляют большую часть генома человека и участвуют, в частности, в регуляции работы генов). Таким образом, в результате одного исследования (секвенирования) генома возможно получить гигантский массив информации, который будет использоваться в клинической практике, как с уже имеющимися данными, так и с данными, которые учёные будут получать по мере научного прогресса в будущем.
Поделитесь этим с друзьями:

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *